روش دقیق برای شناسایی حذف‌ها و افزایش‌های ژنی با اندازه‌گیری تعداد کپی DNA

مقدمه

MLPA روشی مولکولی برای اندازه‌گیری تعداد نسخه‌های ژنی (Copy Number Variation) است که با استفاده از پروب‌های اختصاصی، لیگاسیون و PCR، حذف‌ها و افزوده‌های کوچک در ژن‌ها و کروموزوم‌ها را با دقت بالا شناسایی می‌کند. این روش سریع، دقیق و بسیار کاربردی در تشخیص بیماری‌های ژنتیکی است.

شرح

MLPA یا Multiplex Ligation‑dependent Probe Amplification یکی از تکنیک‌های پیشرفتهٔ ژنتیک مولکولی است که برای شناسایی تغییرات تعداد نسخه‌های ژنی (Copy Number Variations – CNVs) استفاده می‌شود. CNVها شامل حذف‌ها (Deletions)، افزوده‌ها (Duplications) و تغییرات کوچک در ساختار ژن‌ها و کروموزوم‌ها هستند که می‌توانند باعث بیماری‌های ژنتیکی شوند. MLPA به دلیل سرعت بالا، دقت زیاد و توانایی بررسی هم‌زمان ده‌ها ناحیهٔ ژنی، یکی از روش‌های استاندارد در آزمایشگاه‌های ژنتیک بالینی است.

در MLPA از مجموعه‌ای از پروب‌های اختصاصی استفاده می‌شود که هر پروب شامل دو نیمهٔ مکمل DNA است. این نیمه‌ها به ناحیهٔ هدف در ژنوم متصل می‌شوند و تنها در صورتی که هر دو نیمه به‌درستی متصل شوند، توسط آنزیم لیگاز به یکدیگر متصل (Ligate) می‌شوند. این ویژگی باعث می‌شود MLPA بسیار اختصاصی باشد و تنها نواحی صحیح را تکثیر کند. پس از لیگاسیون، پروب‌های کامل‌شده با PCR تکثیر می‌شوند. هر پروب طول متفاوتی دارد، بنابراین پس از تکثیر، قطعات با استفاده از الکتروفورز موئین (Capillary Electrophoresis) از یکدیگر جدا شده و اندازه‌گیری می‌شوند.

خروجی MLPA یک Electropherogram است که پیک‌های مختلفی را نشان می‌دهد. ارتفاع هر پیک نشان‌دهندهٔ مقدار پروب تکثیرشده و در نتیجه تعداد نسخهٔ ژنی مربوطه است. با مقایسهٔ این پیک‌ها با نمونهٔ کنترل، می‌توان حذف‌ها، افزوده‌ها و تغییرات ساختاری را شناسایی کرد. این روش قادر است تغییرات بسیار کوچک (در حد یک اگزون) را تشخیص دهد؛ چیزی که بسیاری از روش‌های دیگر مانند کاریوتایپ قادر به انجام آن نیستند.

MLPA در تشخیص بیماری‌های ژنتیکی نقش حیاتی دارد. برای مثال، در بیماری‌های عصبی‌عضلانی مانند SMA، حذف اگزون‌های ژن SMN1 با MLPA بررسی می‌شود. در سندرم‌های کروموزومی مانند DiGeorge، حذف‌های کوچک کروموزوم 22q11 شناسایی می‌شوند. در سرطان‌ها، MLPA برای بررسی تغییرات تعداد نسخهٔ ژن‌های مرتبط با تومور استفاده می‌شود. همچنین در ژنتیک مولکولی، MLPA برای بررسی جهش‌های ساختاری، تعیین وضعیت هتروزیگوتی و تحلیل CNVها کاربرد دارد.

در مجموع، MLPA یک روش دقیق، سریع و مقرون‌به‌صرفه برای بررسی تغییرات تعداد نسخه‌های ژنی است که در تشخیص بیماری‌های ارثی، سرطان، پژوهش‌های ژنومی و ژنتیک بالینی نقش اساسی دارد.

کاربردهای MLPA

  • تشخیص CNVها — شناسایی حذف‌ها و افزوده‌های ژنی
  • تشخیص SMA — بررسی حذف اگزون‌های ژن SMN1
  • سندرم‌های کروموزومی — تشخیص DiGeorge، Williams، Prader‑Willi
  • سرطان‌شناسی — بررسی تغییرات تعداد نسخهٔ ژن‌های توموری
  • بررسی ژن‌های بیماری‌زا — تحلیل حذف‌ها و افزوده‌های کوچک
  • تعیین هتروزیگوتی — بررسی وجود یک یا دو نسخهٔ ژنی
  • پژوهش‌های ژنومی — تحلیل ساختار ژن‌ها و CNVها

مراحل انجام MLPA (Workflow)

  • استخراج DNA — جداسازی DNA با کیفیت مناسب
  • اتصال پروب‌ها — اتصال دو نیمهٔ پروب به ناحیهٔ هدف
  • لیگاسیون — اتصال دو نیمهٔ پروب توسط لیگاز
  • PCR — تکثیر پروب‌های لیگاشده
  • الکتروفورز موئین — جداسازی قطعات بر اساس اندازه
  • تحلیل Electropherogram — بررسی ارتفاع پیک‌ها و تعیین CNV
  • تفسیر نتایج — مقایسه با کنترل و ارائه گزارش نهایی

ضرورت استفاده از MLPA

  • تشخیص حذف‌ها و افزوده‌های کوچک — روش‌های دیگر قادر به تشخیص آن نیستند
  • سرعت و دقت بالا — بررسی هم‌زمان ده‌ها ناحیهٔ ژنی
  • تشخیص بیماری‌های ارثی — SMA، DiGeorge، Williams و…
  • تحلیل CNVها — بررسی تغییرات تعداد نسخهٔ ژن‌ها
  • پزشکی فردمحور — تعیین وضعیت ژنی برای انتخاب درمان
  • سرطان — بررسی ژن‌های مرتبط با تومور
  • پژوهش‌های ژنومی — تحلیل ساختار ژن‌ها و تغییرات کوچک